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    我所發展RNA“緩沖熒光探針”用于細胞核核仁成像和核仁應激試劑篩選

    近日,我所生物技術研究部分子探針與熒光成像研究組(1818組)喬慶龍副研究員和徐兆超研究員團隊發展了能夠與RNA特異性可逆結合,在活細胞內對細胞核核仁穩定成像的“緩沖熒光探針”Nu-AN,實現了對核仁動態輪廓的成像,并通過活細胞內藥物誘導下核仁特定形態的可視化,為核仁應激試劑的篩選提供可視化的工具。

    核仁是細胞核內最大的無膜細胞器,因其具有多樣的生理和病理功能而受到廣泛關注,這些功能與其形態密切相關。核仁主要作為核糖體生物合成的中心,同時也具有非核糖體功能,包括調控有絲分裂、控制細胞周期和參與細胞應激。核仁在形態方面,包括形狀、大小以及細胞核內核仁數量,反映其生理活性,并與各種人類疾?。ㄈ绨┌Y、神經退行性疾病和衰老)相關。例如,在癌細胞中,由于細胞快速生長和增殖導致對核糖體生物合成和蛋白質合成的迫切需求,使得癌細胞中的核仁比正常細胞中的核仁尺寸更大、數目更多,形狀不規則等。核仁大小也與細胞壽命具有很強的相關性,較小的核仁是細胞長壽的標志。此外,在核仁應激條件下,核仁形態的變化尤為明顯,為疾病診斷和藥物篩選提供了潛在方法。

    然而,核仁形態的熒光成像面臨挑戰。由于這種無膜細胞器的動態性和無定形性,要求核仁探針能夠選擇性地識別整個核仁結構而不干擾核仁功能,并具有高光穩定性,確保進行動態核仁成像。而基因編碼的熒光蛋白標記核仁蛋白的方法會破壞核仁的源生性;現有的小分子染料依賴與RNA的強烈靜電作用標記核仁,不僅在細胞中容易造成熒光背景,還有可能干擾核仁的功能。

    1818組前期開發了細胞內脂滴動態識別“緩沖熒光探針”LD-FGAngew. Chem. Int. Ed.,2021),有效解決了在長時間動態超分辨成像過程中染料光不穩定的問題。受“緩沖熒光探針”策略的啟發,在本工作中,團隊將3-吡咯啉環引入到萘酰亞胺中,開發了可逆結合并識別RNA的核仁“緩沖熒光探針”Nu-AN。研究發現,3-吡咯啉環并入萘酰亞胺熒光團既保持了平面性又保留扭曲分子內電荷轉移(TICT)的特性,同時Nu-AN還表現傳統萘酰亞胺染料氫鍵淬滅熒光的特征。與RNA結合后,Nu-AN駐留在RNA的疏水腔內,抑制TICT并減少氫鍵效應,從而產生熒光增強的效果。Nu-AN是電中性的,并且不含有可質子化的堿性基團,所以與RNA的相互作用較弱,能可逆的與RNA結合并伴隨熒光增強的響應。在活細胞中,Nu-AN可以有效地、可逆地染色核仁,同時避免商品化RNA探針在線粒體或溶酶體中錯誤定位的問題。這種可逆性結合不僅最大限度地減少了對核仁的結構干擾,保留了核仁的活性,而且還在核仁外形成了“染料池”。當核仁內的探針發生光漂白,則可以快速招募來自“染料池”的新探針,確保核仁成像的光穩定性。

    Nu-AN與RNA的可逆結合和選擇性熒光點亮特性確保了對活細胞核仁的特異和穩定的熒光成像,使其特別適用于在不破壞核仁功能的情況下可視化RNA富集的核仁亞結構:顆粒成分(GC)。通過Nu-AN對核仁GC亞結構的標記與基因編碼的熒光蛋白聯合使用,實現核仁整體形態的成像。

    核仁藥物往往會引起核仁形態的變化。借助于Nu-AN對核仁形態的可視化,團隊觀察到兩種藥物誘導核仁形態的特異性變化:ActD處理導致了壓力“帽”的形成和核仁尺寸的減??;在Flavopiridol的影響下,核仁呈現出從緊湊完整狀態到嚴重分散狀態的逐漸過渡。此外,研究還發現前者對核仁的形態影響是不可逆的,而后者形態變化看似劇烈卻是可逆的。這些成像結果也充分說明了核仁作為無膜細胞器的高度流動性和有組織性。

    無膜細胞器逐漸被發現并被作為細胞內一類特殊結構功能單元,但它們不斷變化和無定形的形態特征,使得對其結構和功能的研究一直存在挑戰。核仁作為細胞內眾多的無膜細胞器之一,也是目前已知的最大的無膜細胞器,它的高度動態和精巧的結構賦予了它多功能的特性,使其與細胞內其他功能單元協調統一地維持細胞的生命活動。Nu-AN有望為核仁生物學領域提供活細胞核仁形態學研究的工具,同時,這一探針的設計為細胞內其他無膜細胞器的探針的開發開辟了新的途徑。未來,其他多種無膜細胞器探針的開發將填補無膜細胞器可視化空白,幫助提升對細胞生物學的認知。

    相關研究成果以“RNA Buffering Fluorogenic Probe for Nucleolar Morphology Stable Imaging And Nucleolar Stress-Generating Agents Screening”為題,發表在《先進科學》(Advanced Science)上。該工作的第一作者是我所1818組博士研究生江文鈔。研究工作得到國家自然科學基金、我所創新基金等資助。(文/圖 江文鈔)

    文章鏈接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202309743

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